益生乳酸菌筛选及其对草石蚕汁发酵特性的影响（二）将活化后的选及响3株乳酸菌-灵境云栈

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1.5.2.6 抑菌试验

验利用牛津杯抑菌圈法测定植物乳杆菌ZJ316、益生副干酪乳杆菌ZFM54、乳酸沙克乳杆菌ZFM225的菌筛抑菌性质。将活化后的选及响3株乳酸菌，按3％的其对接种量接至草石蚕菜汁培养基。于37℃培养24h。草石蚕汁草石蚕发酵液于8000r/min离心5min(4℃)，发酵取上清液备用。特性将抑菌试验所需的益生指示菌在合适的培养条件下培养，按1％的乳酸接种量接入50℃左右融化的半固培养基中，混合均匀后倒入牛津杯的菌筛平板上，待完全冷却后拔出牛津杯。选及响用移液枪吸取150μL发酵上清液加入孔洞中，其对37℃培养12h后用游标卡尺测量抑菌圈大小。草石蚕汁

1.5.2.7 产叶酸能力测

定利用德国拜发IFP维生素B₉叶酸微生物法试剂盒对发酵样品中的发酵叶酸含量进行测定。按试剂盒中说明书要求对样品进行处理，将处理后的样品与培养基加入试剂盒自带的微孔板中，用粘合箔封紧后于37℃黑暗条件下培养48h。培养完成后从培养箱中取出微孔板，再次压紧粘合膜并在桌面上震荡，使微生物在培养基中混合均匀。随后轻轻撕下粘合膜，破坏微孔中的所有泡沫，并用酶标仪在波长540nm处测定微孔的0D_540nm值。

1.5.2.8 菌株发酵草石蚕菜汁产生的挥发性风味物质的测定

1)样品处理

将活化后的植物乳杆菌ZJ316、沙克乳杆菌ZFM225、副干酪乳杆菌ZFM54按3％的接种量接种于草石蚕菜汁培养基中，37℃培养24h后取10mL装入15mL顶空进样瓶中。将顶空进样瓶放到50℃水浴锅内加热30min，备用。

2)顶空固相微萃取条件

将老化后的萃取头插入进样瓶顶空部分，50℃平衡30min、吸附30min后，将萃取头取出并插GC进样口。同时启动仪器采集数据，解吸20min。

3)GC-MS条件

7890A/5975GC，MS联用仪；色谱柱：HP-5MS型(30m×0.250mm×0.25μm)；载气：氦气；进样温度：230℃；进样量：1μL；升温程序：初温45℃保持2min，以5℃/min速率上升至180℃，保持1min后以25℃/min速率升到230℃，保持5.5min。

4)数据处理

由计算机质谱系统NSIT检索未知化合物。匹配度大于70％的结果将予以报告，采用面积归一法计算各成分的含量。

1.6 数据分析

上述所有试验均重复3次。所有数据均表示为平均值±标准偏差。数据分析使用Origin9.0处理。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的初步筛选

乳酸菌在草石蚕菜汁培养基中的生长情况，不仅能够反映出乳酸菌对草石蚕菜汁发酵环境的适应能力，也是乳酸菌发酵性能分析的基础，因此本研究通过生长情况测定初步筛选出优质乳酸菌菌株。如图1所示，培养24h后，植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225在草石蚕菜汁培养基中生长情况最好，0D_600nm、值分别为1.84，1.64，1.58，本研究选择这3株乳酸菌进行后续试验。

2.2 发酵性能的测定

2.2.1 最佳接种量的确定

接种量的多少与乳酸菌在培养基中生长情况密切相关，过小的接种量会导致乳酸菌生长密度偏低，而接种量过高则会出现营养匮乏导致菌体死亡的现象，因此确定一个最优的接种量非常重要。如图2所示，植物乳杆菌ZJ316在3％接种量处有最高活菌数8.7×10⁸CFU/mL、沙克乳杆菌ZFM225在3％接种量处有最高活菌数1.7×10⁸CFU/mL、副干酪乳杆菌ZFM54在3％接种量处有最高活菌数2.3×10⁸CFU/mL。因此，植物乳杆菌ZJ316、沙克乳杆菌ZFM225、副干酪乳杆菌ZFM54的最佳接种量均为3％。